Son père est médecin d'origine roumano-polonaise et sa maman est une artiste américaine d'origine autrichienne et russe.

En 1984, la famille de Nathalie émigre aux états-Unis. Elle s'installe au départ à Washington, dans le Connecticut pour finir à Long Island.

En 1999, Nathalie étudie la psychologie à la prestigieuse université de Harvard et décroche son diplôme quatre ans plus tard, en 2003.

Sa carrière commence pourtant bien plus tôt. A l'âge de 11 ans elle est remarquée par un agent de la maison REVLON des produits cosmétiques qui la présente.

Un an plus tard elle obtient son premier rôle dans un film du français Luc Besson. Elle partage ainsi l'affiche de Léon avec Jean Reno et impressionne le public par la qualité de son jeu. La même année elle participe à Heat et fait partie d'un casting de choc avec Al Pacino, Val Kilmer et Robert de Niro.

Elle enchaîne en 1996 par trois films, Beautiful Girls, Tout le monde dit I love you et  Mars Attacks !   

En 1999, remarqué par Georges Lucas, Nathalie participe à la seconde trilogie des ''Guerres des étoiles'' et y incarne Padmé Amidala. Elle se fait doubler par une autre jeune fille qui lui ressemble énormément et qui sera par la suite une véritable star, Keira Knightley.

Depuis elle enchaîne les projets mais ne trouvent pas toujours le succès attendu. Elle revient en 2002 avec le deuxième épisode de Star Wars : L'Attaque des clones.

Deux ans plus tard, elle partage l'affiche de Closer avec un casting de charme composé de Julia Roberts, Jude Law et Clive Owen.

En 2005, elle retrouve la trilogie de Star Wars pour le troisième épisode ''La Revanche des Sith'' et tourne dans le très médiatisée V pour Vendetta de James McTeigue.

Nathalie Portman a remporté en 2005, le Golden Globe Award de la meilleure actrice dans un second rôle pour sa performance dans Closer.

Elle est également lauréate du Saturn Award de la meilleure actrice pour son jeu dans ''V pour Vendetta ''.